Anti-DYKDDDDK (FLAG®)小鼠单克隆抗体偶联Agarose Beads

产品名称： Anti-DYKDDDDK (FLAG®) tag小鼠单抗偶联Agarose Beads

货号：AT0078

品牌：Engibody

对应关键词：

flag gel,

flag affinity gel,

flag 抗体beads,

A2220,

flag M2

Anti-DYKDDDDK (FLAG®) tag小鼠单抗偶联Agarose Beads，适用于FLAG标签融合蛋白的免疫沉淀IP，免疫共沉淀CoIP和flag标签融合蛋白的精细纯化。

产品描述

抗DYKDDDDK（FLAG®）标签小鼠单克隆抗体偶联琼脂糖珠

反应性

所有表达flag标签融合蛋白的系统均可作为样本以便富集捕获flag融合蛋白（包含细菌表达系统，酵母表达系统，昆虫和哺乳动物细胞表达系统及体外无细胞转录翻译系统）

验证过的应用

免疫沉淀（IP），

共免疫沉淀（Co-IP），

flag融合蛋白纯化

在IP中，将40µL珠浆（20µL沉淀珠）用于约500-1000µL细胞裂解液。

最佳稀释度/浓度应由最终用户确定。

beads直径

~90µm（交联8%琼脂糖珠）

结合能力

每1mL珠浆可以结合捕获1mg DYKDDDDK标记的融合蛋白。

Description

Anti- DYKDDDDK (FLAG®) tag mouse monoclonal antibody conjugated Agarose Beads

Reactivity

Species independent

Tested applications

Immunoprecipitation (IP),

Co-Immunoprecipitation (Co-IP),

flag fusion protein purification

In IP, 40 µL of beads slurry (20µL of settled beads) for ~500-1000 µL of cell lysate.

Optimal dilutions/concentrations should be determined by the end user.

Beads Diameter

~ 90 µm (cross-linked 8% agarose beads)

Binding Capacity

>1 mg of DYKDDDDK -tagged fusion protein per 1 mL of beads slurry.

操作流程

注意：琼脂糖珠在用于 IP 和纯化之前应充分重悬。

来自哺乳动物细胞提取物的 DYKDDDDK 标记融合蛋白的免疫沉淀 (IP) 方案

1. 样品裂解液制备

注意：该程序建议使用两个对照反应。第一个对照是使用 FLAG-BAP 融合蛋白进行免疫沉淀（阳性对照），第二个是不含蛋白质的试剂空白（阴性对照）。

建议使用 CelLytic B 裂解试剂（sigma，货号 B7435、B7310 或 C8740）或 CelLytic B Plus 试剂盒（sigma，货号 CB0050 或 CB0500）进行细菌裂解。

IP 裂解缓冲液（50 mM Tris HCl，pH 7.4，含 150 mM NaCl、1 mM EDTA 和 1% TRITON X-100）或 CelLytic M（sigma，目录号 C2978）可用于哺乳动物细胞。

A. 使用 CelLytic Lysis Reagents 检测大肠杆菌的推荐步骤

1. 在诱导产生 FLAG 融合蛋白的条件下培养细胞（约 1 升或更少）。

2. 通过在 2-8 °C 下以 5,000×g 离心 30 分钟来收获细胞。

3. 从细胞糊中倒出培养基。

4. 使用干冰/乙醇浴或在–20 °C 的冰箱中冷冻细胞糊。在缓慢冷冻期间，细胞裂解得到增强。

5. 每克冷冻细胞糊使用 10 ml CelLytic B（sigma，货号 B7435）或每克冷冻细胞糊 5 ml CelLytic B，2×浓缩液（sigma，货号 B7310）裂解冷冻细胞。

6. 用移液器将细胞重悬在 CelLytic B 试剂中。在搅拌板上剧烈混合 15 分钟以充分提取蛋白质。

7. 以 21,000×g 离心 15 分钟去除细胞碎片。

8. 离心后，将上清液倒入新容器中，弃去细胞沉淀。溶液应清澈无不溶性颗粒。

B. 哺乳动物细胞的推荐步骤

对于 70–90% 汇合的 100 mm 培养皿（106–107 个细胞），使用 1 ml IP 裂解缓冲液（50 mM Tris HCl，pH 7.4，含 150 mM NaCl、1 mM EDTA 和 1% TRITON X-100） .如果 FLAG 融合蛋白的表达水平相对较低，请使用减少量的 IP 裂解缓冲液裂解细胞。强烈建议将蛋白酶抑制剂混合物（sigma，目录号 P8340）添加到 IP 裂解缓冲液中（每 1 ml 裂解缓冲液 10 ml），特别是如果要储存裂解液以供进一步使用。

1. 酌情清洗贴壁或悬浮细胞：

贴壁细胞 - 从待分析的细胞中去除生长培养基。用 PBS 缓冲液冲洗细胞两次，注意不要移动任何细胞。丢弃 PBS。添加裂解缓冲液 (106–107cells/ml)。

悬浮细胞 - 将细胞收集到合适的锥形离心管中。 420×g 离心 5 分钟。倒出上清液并丢弃。用 PBS 重悬细胞沉淀，洗涤细胞两次，并以 420×g 离心 5 分钟。倒出上清液并丢弃。在裂解缓冲液（106–107 个细胞/ml）中重悬细胞沉淀。

2. 在振荡器上孵育细胞 15–30 分钟。

3. 仅对贴壁细胞，刮取并收集细胞。对于悬浮细胞，请继续执行步骤 4。

4. 以 12,000×g 离心细胞裂解物 10 分钟。

5. 将上清液转移到冷冻试管中。立即使用，保持在冰上。如果

上清液不要立即使用，将其储存在 –70 °C。

2. 预洗凝胶珠以平衡珠并去除产物缓冲液。

1. 通过倒置产品管或移液器吸头*重悬抗标记琼脂糖凝胶。注意：这一步非常重要。确保很好地重新悬浮凝胶。不要涡旋琼脂糖珠。

2. 立即将 40ml 凝胶悬浮液转移到新试管中，加入 0.5ml TBS（50 mM Tris HCl，含 150 mM NaCl，pH 7.4），然后重悬珠子并充分混合 TBS。将凝胶悬浮液以 5,000×g 离心 30 秒，小心去除上清液，确保去除大部分洗涤缓冲液并且没有丢弃凝胶珠。此步骤应重复 3-4 次。

如果有大量免疫沉淀样品，请一起清洗所有样品所需的凝胶珠。洗涤后，根据测试样品的数量划分凝胶。每次洗涤应使用体积等于总填充珠体积 20 倍的 TBS 进行。

注意：对于凝胶转移，使用干净的塑料移液器吸头，末端扩大，以便凝胶转移。

3. FLAG 融合蛋白免疫沉淀

1. 将 200–1,000 ml 的大肠杆菌提取物或细胞裂解物加入清洗过的凝胶中。如有必要，通过添加 IP 裂解缓冲液（50 mM Tris HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1% TRITON X-100）使最终体积达到 1 ml。

注意：要使用的大肠杆菌提取物或细胞裂解物的体积取决于转染细胞或细菌中 FLAG 融合蛋白的表达水平。对于阳性对照，在洗过的凝胶中加入 1 ml TBS 和 4 ml 50 ng/ml FLAG-BAP 融合蛋白（~200 ng）。对于阴性对照，仅添加 1 ml 不含蛋白质的 IP 裂解缓冲液。待沉淀的 FLAG-BAP 融合蛋白的量取决于检测方法。 200 ng 蛋白质足以进行活性测定或免疫印迹分析。

对于考马斯蓝或银染色的 SDS-PAGE 分析，使用 1 mg 的 FLAG-BAP 融合蛋白。

2. 轻轻搅动或摇动所有样品和对照品（推荐使用滚筒振荡器）2 小时。为了提高结合效率，结合步骤可以延长一夜。

4. 洗涤免疫复合物以去除非特异性结合蛋白。

1. 以 5,000–8,000×g 离心树脂 30 秒。用窄端移液器吸头去除上清液。

2. 用 0.5 ml TBS（50 mM Tris HCl，含 150 mM NaCl，pH 7.4）洗涤凝胶 3 次。确保使用 Hamilton 注射器或等效装置去除所有上清液。

5. FLAG 融合蛋白的洗脱和获得

根据蛋白质特性或进一步使用，推荐三种洗脱方法：

选项 A：在天然条件下通过与 FLAG 肽竞争的蛋白质洗脱。使用这种方法的洗脱效率非常高。

选项 B：在酸性条件下用 0.1 M glycine HCl，pH 3.5 洗脱。这是一种快速有效的洗脱方法。用中和缓冲液（0.5 M Tris HCl，含 1.5 M NaCl，pH 7.4）平衡洗脱的蛋白质可能有助于保持其活性。

选项 C：与上样缓冲液一起煮沸，离心并获得用于凝胶电泳和蛋白质印迹的上清液。

选项 A：使用 FLAG 肽进行洗脱

1. 准备 FLAG 洗脱液。将 FLAG 肽（Engibdoy，目录号 P5201）溶解在 0.5 M Tris HCl，pH 7.5 和 1 M NaCl 中，浓度为 25 mg/ml。用水稀释 5 倍以制备含有 5 mg/ml FLAG 肽的 FLAG 储备溶液。对于洗脱，将 3 ml 的 5 mg/ml FLAG 肽原液添加到 100 ml TBS（150 ng/ml 终浓度）中。

2. 向每个样品和对照树脂中加入 100 ml FLAG 洗脱液。

3. 将样品和对照在 2–8 °C 下轻轻摇晃孵育 30 分钟。

4. 以 8,000×g 离心凝胶 60 秒。使用 Hamilton 注射器或等效装置将上清液转移到新试管中。小心不要转移任何凝胶珠。

5. 为了立即使用，例如蛋白质印迹，将洗脱的蛋白质储存在 2–8 °C。在 –20 °C 下长期储存。

对于下游蛋白质印迹分析，向洗脱的蛋白质中加入适当的 SDS-PAGE 上样缓冲液并煮沸，然后将样品和对照准备好上样到 SDS-PAGE 上，并使用抗 FLAG 或针对融合蛋白的特异性抗体进行免疫印迹。

选项 B：用 0.1 M glycine  HCl，pH 3.5 洗脱

该程序应在室温下进行。

注意：不要将凝胶珠留在此缓冲液中超过 20 分钟。

1. 将 100 ml 0.1 M 盐酸glycine缓冲液 (pH 3.5) 添加到每个样品和对照凝胶中。

2. 将样品和对照在室温下轻轻摇晃 5 分钟。

3. 以 8,000×g 离心凝胶 60 秒。

4. 使用 Hamilton 注射器或等效装置将上清液转移到新试管中。小心不要转移任何凝胶珠。

5. 为了平衡洗脱液，立即向每个样品中加入 10 ml 中和缓冲液（0.5 M Tris HCl，含 1.5 M NaCl，pH 7.4）。

6. 为了立即使用，例如蛋白质印迹，将洗脱的蛋白质储存在 2–8 °C。在 –20 °C 下长期储存。

对于下游蛋白质印迹分析，向洗脱的蛋白质中加入适当的 SDS-PAGE 上样缓冲液并煮沸，然后将样品和对照准备好上样到 SDS-PAGE 上，并使用抗 FLAG 或针对融合蛋白的特异性抗体进行免疫印迹。

选项 C：与上样缓冲液一起煮沸，离心并获得用于凝胶电泳和蛋白质印迹的上清液。

该程序应在室温下进行。上样缓冲液在使用前应处于室温。为了尽量减少抗体的变性和洗脱，上样缓冲液中不应包含还原剂（ DTT）。添加还原剂将导致固定化抗 FLAG 抗体的重链和轻链解离（25 和 50 kDa 条带）。如果还原条件是绝对必要的，可以添加还原剂。 1×上样缓冲液（62.5 mM Tris HCl，pH 6.8，含 2% SDS、10% (v/v) 甘油和 0.002% 溴酚蓝）中 DTT 的最终浓度应为 5% 或50 毫米，分别。

注意：样品缓冲液中的 SDS 会使抗 FLAG 抗体变性，经 SDS-PAGE 上样缓冲液处理后的抗 FLAG 亲和凝胶不能重复使用。

1. 向每个样品和对照中加入 20 ml 2×上样缓冲液（125 mM Tris HCl，pH 6.8，含 4% SDS、20% (v/v) 甘油和 0.004% 溴酚蓝）。

2. 将样品和对照煮沸 3 分钟。

3. 将样品和对照以 8,000×g 离心 60 秒以沉淀任何未溶解的琼脂糖珠。用 Hamilton 注射器或吸管将上清液转移到新试管中。样品和对照已准备好上样到 SDS-PAGE 上，并使用抗 FLAG 或针对融合蛋白的特异性抗体进行免疫印迹。