免疫沉淀IP试剂盒

产品名称： IP Kit， IP试剂盒（琼脂糖珠法）

货号： IF6801

品牌：Engibody

对应关键词：IP Kit, IP试剂盒，免疫沉淀Kit

试剂盒优势

1、Protein A/G琼脂糖珠确保与大多数一抗的良好结合，无论是来自小鼠源抗体还是兔源抗体

2、在30分钟内快速免疫沉淀，以减少背景并提高瞬时蛋白质复合物的捕获

3、在洗涤剂、低pH缓冲液或普通质谱溶剂存在下，蛋白质A/G不会脱落

4、方便，全面的IP试剂盒包含琼脂糖珠和完成免疫沉淀实验的所有必要缓冲液以及抗体的同型对照

5、现货库存，订购秒发

试剂盒描述

免疫沉淀（IP）试剂盒（蛋白A/G琼脂糖珠）

适用实验

•传统IP和下游WB

•IP用于非还原条件下的下游分析，如酶活性测定、蛋白质结构研究

试剂盒组分

足够用于：40个IP反应，使用25µL beads悬液/反应

•蛋白A/G琼脂糖珠，1 mL，组分货号：IF0001，储存于4°C

•IP裂解缓冲液，50 mL，组分货号：IF6601，储存于4°C

•IP洗涤缓冲液，50 mL，组分货号：IF9210，储存于4°C

•洗脱缓冲液，4 mL，组分货号：IF9213，储存于4°C

•中和缓冲液，0.5 mL，组分货号：IF9216，储存于4°C

•样品上样缓冲液（还原和变性，5X），1 mL，组分货号：IF6740，储存于-20°C

•正常兔IgG（全分子）同型对照，100μL，组分货号：AT1597，-20°C储存

•正常小鼠IgG（全分子）同型对照，100μL，组分货号：AT1596，-20°C储存

试剂盒描述

Immunoprecipitation(IP) 试剂盒(Protein A/G Agarose Beads)

适用实验

• Traditional IP and downstream WB

• IP for downstream analysis in nonreducing conditions, such as enzyme activity assay, protein structure research

试剂盒组分

Sufficient For: 40 IP reactions, using 25 µL of beads slurry/reaction

• Protein A/G Agarose Beads, 1 mL, Cat: IF0001, store at 4°C

• Lysis Buffer for IP, 50 mL, Cat: IF6601, store at 4°C

• Wash Buffer for IP, 50 mL, Cat: IF9210, store at 4°C

• Elution Buffer, 4 mL, Cat: IF9213, store at 4°C

• Neutralization Buffer, 0.5 mL, Cat: IF9216, store at 4°C

• Sample Loading Buffer (Reducing and Denaturing, 5X), 1 mL, Cat: IF6740, store at -20°C

• Normal Rabbit IgG (Whole Molecule) Isotype Control,100 μL, Cat: AT1597, store at -20°C

• Normal Mouse IgG (Whole Molecule) Isotype Control,100 μL, Cat: AT1596, store at -20°C

IP免疫沉淀流程

A、 哺乳动物细胞裂解

方案一：贴壁细胞培养物的裂解

1.小心地从细胞中取出培养基。

2.用1X PBS洗涤细胞一次。

3.向细胞中加入冰冷的IP裂解缓冲液（货号：IF6601）。在冰上孵育10-20分钟，定期混合。

注：蛋白酶/磷酸酶抑制剂cocktail应添加到裂解缓冲液中。蛋白酶抑制剂在水溶液中迅速失活，应在使用前立即添加到溶液中。

表1.用于不同标准培养板的IP裂解缓冲液的建议体积。

板尺寸/表面积      IP裂解缓冲液体积

100 mm皿           500-1000μL

60 mm皿             250-500μL

4.将裂解物转移到微离心管中，并在约13000×。

5.将上清液转移到新试管中，用于蛋白质浓度测定和进一步分析。

方案二：悬浮细胞培养物的裂解

1.以1000×g离心细胞悬浮液5分钟，使细胞沉积。丢弃上清液。

2.通过将细胞颗粒悬浮在PBS中洗涤细胞一次。以1000×g离心5分钟，使细胞颗粒化。

3.将预冷的IP裂解缓冲液（货号：IF6601）添加到细胞中。每50 mg细胞（即10:1 v/w），使用500μL的IP裂解缓冲液。如果使用大量细胞，首先向细胞中加入最终体积的10%的IP溶解缓冲液，然后上下移液混合。将剩余体积的IP裂解缓冲液添加到细胞悬浮液中。

注：蛋白酶/磷酸酶抑制剂cocktail应添加到裂解缓冲液中。蛋白酶抑制剂在水溶液中迅速失活，应在使用前立即添加到溶液中。

4.在冰上孵育裂解物5分钟，并定期混合。以约13000×g离心10分钟，去除细胞碎片。将上清液转移到新的试管中进行蛋白质浓度测定和进一步分析。

B、 使用蛋白A/G琼脂糖珠预清除裂解产物（此步骤是可选的，预清除裂解物将减少蛋白质与琼脂糖珠子的非特异性结合。如果下游分析中出现高背景，则可以执行此步骤。）

1.通过向每1mL细胞裂解液中加入20µL蛋白质A/G琼脂糖悬液，并在4°C下在旋转器上孵育10分钟，预先结合细胞裂解液中的非特异性蛋白。

2.通过在4°C下14000xg离心5分钟，去除蛋白A/G琼脂糖珠。将上清液（细胞裂解液）转移到冰上的新鲜离心管中。

注意：在离心后的这一步骤中，应丢弃蛋白A/G琼脂糖珠，应保存上清液以备进一步IP。

3.测定细胞裂解物的蛋白质浓度（例如，如果进行Bradford测定，则在测定蛋白质浓度之前必须将细胞裂解物稀释至少1:10。

C、 免疫沉淀IP

注意：

•蛋白质A/G琼脂糖珠（组分货号：IF0001）应在使用前充分悬浮。

•除非另有说明，否则在4°C下执行所有IP步骤。

•所需抗体-抗原复合物的量和孵育时间取决于所用系统和抗体的亲和力、蛋白质相互作用，必须针对每个系统进行优化。

•可能需要优化每个应用步骤的binding时间

1.将1 mL上述细胞裂解物或约1000µg总细胞蛋白转移到1.5 mL微离心管中。添加推荐体积的一抗（最佳抗体浓度应根据抗体说明书确定）和正常IgG（2.5µL），然后在旋转器上在4°C下孵育2小时或过夜。

注：正常兔IgG（Cat:AT1597）是一种非特异性抗体，可作为兔一抗的同种型对照。正常小鼠IgG（Cat:AT1596）也是一种非特异性抗体，可作为小鼠一抗的同种型对照。

2.添加25µL-40µL充分悬浮的蛋白A/G琼脂糖珠悬液，以捕获抗原抗体免疫复合物。在旋转装置上于4°C下孵育1-2小时。

3.通过在4°C下以2500 rpm（约1000xg）离心5分钟收集免疫沉淀复合物。仔细抽吸并丢弃上清液。

4.用0.5 mL IP洗涤缓冲液（货号：IF9210）洗涤复合物2-3次，每次在温和旋转装置上洗涤5-10分钟，并重复上述离心步骤。

提示：如果出现高背景，请将洗涤次数增加至5-6次。

D、 抗原蛋白的洗脱和获得

推荐两种方法：

选项A：用洗脱缓冲液洗脱（货号：IF9213）。这是一种快速有效的洗脱方法。用中和缓冲液（Cat:IF9216）平衡洗脱的蛋白质可能有助于保持其活性。

选项B：用样品loading buffer缓冲液（货号：IF6740）煮沸，离心并获得上清液，用于凝胶电泳和蛋白质印迹。

选项A：用洗脱缓冲液洗脱（非变性洗脱）

该步骤应在室温下进行。

注意：珠子在缓冲液中的停留时间不得超过20分钟。

1.向每个样品和对照珠复合物中添加100µL洗脱缓冲液。

2.在室温下轻轻摇晃样品和对照5分钟。

3.以8000×g离心珠子复合物60秒。

4.将上清液转移到新鲜试管中。小心不要转移任何珠子。

5.为了平衡洗脱液，立即向每个样品中添加10µL中和缓冲液。然后使用pH计确保pH值为7-8。

6.立即使用时，将洗脱的蛋白质储存在2-8°C。储存在-20°C下，以便长期储存。

选项B：用样品loading buffer工作液煮沸，离心并获得用于凝胶电泳和蛋白质印迹的上清液。（变性洗脱）

该步骤应在室温下进行。样品上样缓冲液在使用前应处于室温。

1.制备样品loading buffer工作液，向24µL裂解缓冲液中加入6µL 5×laoding buffer。

2.向每个样品和对照珠子复合物中添加30µL样品loading buffer工作液。

3.将样品和对照煮沸10分钟以使免疫复合物与珠分离。

4.将样品和对照品在8000×g离心60秒，以使任何未溶解的琼脂糖珠子沉淀。将上清液转移到新鲜试管中。样品和对照准备好进行SDS-PAGE和免疫印迹。