CoIP试剂盒（磁珠法）

产品名称：Magnetic Co-IP Kit，磁珠法Co-IP试剂盒

货号： IF9058    

品牌：Engibody

CoIP试剂盒（磁珠法）在30分钟内快速免疫沉淀，以减少背景并提高瞬时蛋白质复合物的捕获，在洗涤剂、低pH缓冲液或普通质谱溶剂存在下，蛋白质A/G不会脱落。

试剂盒组分

Kit Contents:

Sufficient For: 40 Co-IP reactions, using 25 µL of magnetic beads slurry/reaction

• Protein A/G Magnetic Beads, 1 mL, Cat: IF0002, store at 4°C.

• Lysis Buffer for Co-IP, 50 mL, Cat: IF6603, store at 4°C

• Wash Buffer for Co-IP, 50 mL, Cat: IF9212, store at 4°C

• Elution Buffer, 4 mL, Cat: IF9213, store at 4°C

• Neutralization Buffer, 0.5 mL, Cat: IF9216, store at 4°C

• Sample Loading Buffer (Reducing and Denaturing, 5X), 1 mL, Cat: IF6740, store at -20°C

• Normal Rabbit IgG (Whole Molecule) Isotype Control,100 μL, Cat: AT1597, store at -20°C

• Normal Mouse IgG (Whole Molecule) Isotype Control,100 μL, Cat: AT1596, store at -20°C

试剂盒优势

1、Protein A/G磁珠确保与大多数一抗的良好的结合，无论是来自小鼠源抗体还是兔源抗体

2、在30分钟内快速免疫沉淀，以减少背景并提高瞬时蛋白质复合物的捕获

3、在洗涤剂、低pH缓冲液或普通质谱溶剂存在下，蛋白质A/G不会脱落

4、方便，全面的Co-IP试剂盒包含磁珠和完成免疫沉淀实验的所有必要缓冲液

5、磁珠可以通过磁力架进行磁性分离，简单高效，免去了常规离心步骤

6、现货库存，订购秒发

磁珠法CoIP免疫共沉淀流程

A、 哺乳动物细胞裂解

方案一：贴壁细胞培养物的裂解

1.小心地从细胞中取出培养基。

2.用1X PBS洗涤细胞一次。

3.向细胞中加入用于CoIP的预冷裂解缓冲液（货号：IF6603）。在冰上孵育10-20分钟，定期混合。

注意：蛋白酶/磷酸酶抑制剂cocktail应添加到裂解缓冲液中。蛋白酶抑制剂在水溶液中迅速失活，应在使用前立即添加到溶液中。

表1.用于不同标准培养板的CoIP裂解缓冲液的建议体积。

尺寸/表面积       CoIP裂解缓冲液体积

100 mm皿           500-1000μL

60 mm皿             250-500μL

4.将裂解物转移到微离心管中，并在约13000×g转速下离心。

5.将上清液转移到新试管中，用于蛋白质浓度测定和进一步分析。

注意：最佳裂解物浓度取决于目标蛋白的表达水平。建议起始浓度为250μg/mL-1.0 mg/mL。

方案二：细胞悬浮培养物的裂解

1.以1000×g离心细胞悬浮液5分钟，使细胞沉积。丢弃上清液。

2.通过将细胞悬浮在PBS中洗涤细胞一次。以1000×g离心5分钟，使细胞沉积。

3.将冰冷的CoIP裂解缓冲液（货号：IF6603）添加到细胞中。每50 mg细胞（即10:1 v/w）使用500μL用于CoIP的裂解缓冲液。如果使用大量细胞，首先向细胞中加入10%的最终体积的CoIP裂解缓冲液，并上下移液混合。将剩余体积的CoIP裂解缓冲液添加到细胞悬浮液中。

注意：蛋白酶/磷酸酶抑制剂cocktail应添加到裂解缓冲液中。蛋白酶抑制剂在水溶液中迅速失活，应在使用前立即添加到溶液中。

4.在冰上孵育裂解物5分钟，并定期混合。以约13000×g离心10分钟，去除细胞碎片。将上清液转移到新的试管中进行蛋白质浓度测定和进一步分析。

注意：最佳裂解物浓度取决于目标蛋白的表达水平。建议起始浓度为250μg/mL-1.0 mg/mL。

B、 使用蛋白A/G磁珠预清除裂解产物（此步骤是可选的，预清除裂解物将减少蛋白质与磁珠的非特异性结合。如果下游分析中出现高背景，则可以执行此步骤。）

1.通过每1mL细胞裂解液添加20µL蛋白质A/G磁珠浆液，并在4°C下在旋转器上孵育10分钟，预先清除细胞裂解液。

2.用24管磁分离架（货号：IF9050）去除蛋白质A/G磁珠。将上清液（细胞裂解液）转移到冰上的洁净离心管中。

注：在磁分离后的这一步骤中，应丢弃蛋白质A/G磁珠，应保存上清液以备进一步的CoIP。

3.测定细胞裂解物的蛋白质浓度（例如，如果进行Bradford测定，则在测定蛋白质浓度之前必须将细胞裂解物稀释至少1:10。

C、免疫共沉淀 CoIP

注：

•蛋白质A/G磁珠（货号：IF0002）应在使用前充分悬浮。

•除非另有说明，否则在4°C下执行所有Co-IP步骤。

•所需诱饵-猎物复合物的数量和孵育时间取决于所使用的系统以及抗体、诱饵和猎物相互作用的亲和力，必须针对每个系统进行优化。

1.将1 mL上述细胞裂解物或约1000µg总细胞蛋白转移到1.5 mL微离心管中。添加推荐体积的一级抗体（最佳抗体浓度应根据抗体数据表确定）和正常IgG（2.5µL），然后在旋转器上在4°C下孵育2小时或过夜。

注：正常兔IgG（Cat:AT1597）是一种非特异性抗体，可作为兔一抗的同种型对照。正常小鼠IgG（Cat:AT1596）也是一种非特异性抗体，可作为小鼠一抗的同种型对照。

2.添加25µL-40µL再悬浮体积的蛋白质A/G磁珠浆料，以捕获诱饵-猎物免疫复合物。在摇臂平台或旋转装置上在4°C下孵育1-2小时。

3.在4°C下用24管磁分离架（货号：IF9050）收集免疫沉淀复合物。仔细抽吸并丢弃上清液。

4.用0.5 mL CoIP洗涤缓冲液（货号：IF9212）洗涤复合物2-3次，每次洗涤持续5-10分钟。每次清洗前，通过吸移管吸头重新悬浮珠子复合颗粒。

提示：如果出现高背景，请将洗涤次数增加至5-6次。

D、 诱饵蛋白和猎物蛋白的洗脱和获得

根据蛋白质特性或进一步使用，推荐两种方法：

选项A：用洗脱缓冲液洗脱（货号：IF9213）。这是一种快速有效的洗脱方法。用中和缓冲液（Cat:IF9216）平衡洗脱的蛋白质可能有助于保持其活性。

选项B：用样品加载缓冲液（货号：IF6740）煮沸，离心并获得上清液，用于凝胶电泳和蛋白质印迹。

选项A：用洗脱缓冲液洗脱（非变性洗脱）

该程序应在室温下进行。

注意：珠子在缓冲液中的停留时间不得超过20分钟。

1.向每个样品和对照珠复合物中添加100µL洗脱缓冲液，并通过移液器抽吸重新悬浮珠复合物颗粒。

2.在室温下孵育样品和对照5分钟。

3.24管磁选架磁选。

4.将上清液转移到新鲜试管中。小心不要转移任何珠子。

5.为了平衡洗脱液，立即向每个样品中添加10µL中和缓冲液。然后使用pH计确保pH值为7-8。

6.立即使用时，将洗脱的蛋白质储存在2-8°C。储存在-20°C下，以便长期储存。

选项B：用样品加载缓冲液工作溶液煮沸，离心并获得用于凝胶电泳和蛋白质印迹的上清液。（变性洗脱）

该程序应在室温下进行。样品加载缓冲液在使用前应处于室温。

1.制备样品加载缓冲液工作溶液，向24µL裂解缓冲液中加入6µL 5×。

2.向每个样品和对照珠复合物中添加30µL样品加载缓冲液工作溶液，短暂涡旋混合，短暂微离心沉淀样品

3.将样品和对照煮沸10分钟以使免疫复合物与珠分离。

4.使用磁选架的颗粒珠。上清液是样品。将上清液转移到新鲜试管中。样品和对照准备好进行SDS-PAGE和免疫印迹。